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  • KIT ELISA de RNA de fita dupla (dsRNA) HCP0033A

KIT ELISA de RNA de fita dupla (dsRNA)


Número do gato: HCP0033A

Pacote: 48T/96T

Este kit é um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) acoplado ao sistema biotina-estreptavidina.

Descrição do produto

Informações do produto

Este kit é um Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA) acoplado ao sistema biotina-estreptavidina, para medição quantitativa de dsRNA com comprimento acima de 60 pares de bases (pb), independente da sequência.A placa foi pré-revestida com anticorpo anti-dsRNA.O dsRNA presente na amostra é adicionado e se liga aos anticorpos revestidos nos poços.E então o anticorpo anti-dsRNA biotinilado é adicionado e se liga ao dsRNA na amostra.Após a lavagem, a HRP-estreptavidina é adicionada e se liga ao anticorpo anti-dsRNA biotinilado.Após a incubação, a HRP-estreptavidina não ligada é removida por lavagem.Em seguida, a solução de substrato TMB é adicionada e catalisada por HRP para produzir um produto de cor azul que mudou para amarelo após a adição da solução de parada ácida.A densidade do amarelo é proporcional à quantidade alvo de dsRNA capturado na placa.A absorvância é medida a 450 nm.


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  • Aplicativo

    Este kit é para medição quantitativa de dsRNA residual.

      

    Componentes do kit

     

    Componentes

    HCP0033A-1

    HCP0033A-2

    1

    Elisa Microplaca

    8×6

    8×12

    2

    Anticorpo de Detecção Biotinilado (100x)

    60μL

    120μL

    3

    Hrp-Estreptavidina (100x)

    60μL

    120μL

    4

    Tampão de diluição

    15mL

    30mL

    5

    Solução de substrato Tmb

    6mL

    12mL

    6

    Parar solução

    3mL

    6mL

    7

    Tampão de Lavagem Concentrado (20x)

    20mL

    40mL

    8

    Padrão (UTP, 5ng/μL)

    7,5μL

    15μL

    9

    Padrão (pUTP,5ng/μL)

    7,5μL

    15μL

    10

    Padrão (N1-Me-pUTP, 5ng/μL)

    7,5μL

    15μL

    11

    Padrão (5-OMe-UTP, 5ng/μL)

    7,5μL

    15μL

    12

    Tampão STE

    25mL

    50mL

    13

    Seladora de placas

    2 pedaços

    4 pedaços

    14

    Manual de instruções e COA

    1 cópia

    1 cópia

     

    Armazenamento e estabilidade

    1. Para kit não utilizado: O kit inteiro pode ser armazenado a 2 ~ 8 ℃ durante o prazo de validade.A luz forte deve ser evitada para estabilidade de armazenamento.

     

     

    2. Para o kit usado: Depois que a microplaca for aberta, cubra os poços não utilizados com o selador de placa e retorne à bolsa de alumínio que contém o pacote dessecante, feche a bolsa de alumínio com zíper e retorne para 2 ~ 8 ℃ o mais rápido possível após o uso.Outros reagentes devem ser retornados a 2~8°C o mais rápido possível após o uso.

     

    Materiais necessários, mas não fornecidos

    1. Leitor de microplacas com filtro de 450±10 nm (melhor se puder detectar em comprimentos de onda de 450 e 650 nm).

    2. Agitador de microplacas.

    3. Pontas e tubos de centrífuga sem RNase.

     

    Fluxograma de Operação

     ”"

     

     

    Antes de você começar

    1. Deixe todos os componentes do kit e amostras à temperatura ambiente (18-25°C) antes de usar.Se o kit não for usado de uma só vez, retire apenas as tiras e os reagentes para o presente experimento e deixe as tiras e os reagentes restantes nas condições exigidas.

    2. Tampão de lavagem: diluir 40mL de tampão de lavagem 20× concentrado com 760mL de água desionizada ou destilada para preparar 800mL de tampão de lavagem 1×.

    3. Padrão: girar ou centrifugar brevemente a solução estoque antes de usar.A concentração dos quatro padrões fornecidos é de 5ng/μL.Para padrões UTP e pUTP dsRNA, dilua a solução estoque para 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0pg/μL com tampão STE para desenhar a curva padrão.Para padrões de dsRNA N1-Me-pUTP, dilua a solução estoque para 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL com tampão STE para desenhar a curva padrão.Para o padrão 5-OMe-UTP dsRNA, dilua a solução estoque para 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL com tampão STE para desenhar a curva padrão.Recomendamos que os padrões possam ser diluídos conforme os gráficos a seguir:

     

    Padrões de dsRNA N1-Me-pUTP

     

    Não.

     

    Final Con.

    (pg/μL)

    Instrução de diluição

    STE

    amortecedor

     

    padrão

     

     

    A

     

    B

    C

    D

    E

    F

    G

    H

    100

     

    2

     

    1

    0,5

    0,25

    0. 125

    0,0625

    0,0312

    0

    49μL

     

    490μL

     

    250μL

    250μL

    250μL

    250μL

    250μL

    250μL

    250μL

    1μL 5ng/μL padrão

    10μL 100pg/μL

    solução

    250μL de solução A

    250μL de solução B

    250μL de solução C

    250μL de solução D

    250μL solução E

    250μL de solução F

    /

    Para padrão dsRNA 5-OMe-UTP

     

    Não.

     

    Final Con.

    (pg/μL)

    Instrução de diluição

    STE

    amortecedor

     

    padrão

     

     

     

    A

     

    B

    C

    D

    E

    F

    G

    H

     

    100

     

    4

     

    2

    1

    0,5

    0,25

    0. 125

    0,0625

    0

     

    49μL

     

    480μL

     

    250μL

    250μL

    250μL

    250μL

    250μL

    250μL

    250μL

    1μL 5ng/μL

    padrão

    20μL 100pg/μL

    solução

    250μL de solução A

    250μL de solução B

    250μL de solução C

    250μL de solução D

    250μL solução E

    250μL de solução F

    /

    4. Anticorpo de detecção biotinilado e solução de trabalho de HRP-estreptavidina: girar ou centrifugar brevemente a solução estoque antes de usar.Dilua-os até a concentração de trabalho com tampão de diluição.

    5. Subestado TMB: aspire a dosagem necessária da solução com pontas esterilizadas e não despeje novamente a solução residual no frasco.O subestado TMB é sensível à luz, não exponha o substrato TMB à luz por muito tempo.

     

    Usando protocolo

    1. Determine o número de tiras necessárias para o ensaio.Insira as tiras nas molduras para uso.As restantes tiras de placas não utilizadas neste ensaio devem ser reembaladas no saco com dessecante.Feche bem o saco para armazenamento refrigerado.

    2. Adicione 100 μL de cada diluição do padrão, do branco e das amostras nos poços apropriados.Cubra com o selador de placas.Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação a 500 rpm.As amostras devem ser diluídas com tampão STE até a concentração apropriada para um ensaio preciso.

    3. Etapa de lavagem: Aspirar a solução e lavar com 250μL de tampão de lavagem em cada poço e deixar repousar por 30s.Descarte completamente o tampão de lavagem, encaixando a placa em papel absorvente.Lave totalmente 4 vezes.

    4. Adicione 100μL de solução de trabalho de anticorpo de detecção biotinilado em cada poço.Cubra com o selador de placas.Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação a 500 rpm.

    5. Repita a etapa de lavagem.

    6. Adicione 100 μL de solução de trabalho HRP-estreptavidina em cada poço.Cubra com o selador de placas.Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente com agitação a 500 rpm.

    7. Repita a etapa de lavagem novamente.

    8. Adicione 100 μL de solução de substrato TMB em cada poço.Cubra com o selador de placas.Incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Proteger da luz.O líquido ficará azul com a adição de solução de substrato.

    9. Adicione 50 μL de solução de parada em cada poço.O líquido ficará amarelo com a adição da solução de parada.Em seguida, execute o leitor de microplacas e realize a medição a 450 nm imediatamente.

     

    Cálculo de Resultados

    1. Calcule a média das leituras duplicadas para cada padrão, controle e amostras e subtraia a média da densidade óptica padrão zero.Construa uma curva padrão com absorbância no eixo vertical (Y) e concentração de dsRNA no eixo horizontal (X).

    2. Recomenda-se realizar o cálculo com software de ajuste de curva baseado em computador, como curve expert 1.3 ou ELISA Calc, em um modelo de ajuste não linear de 5 ou 4 parâmetros.

    Desempenho

    1. Sensibilidade:

    limite inferior de detecção: ≤ 0,001pg/μL (para UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01pg/μL (para 5-OMe-UTP-dsRNA).

    limite inferior de quantificação: 0,0156 pg/μL (para UTP-, pUTP-dsRNA),0,0312 pg/μL (para N1-Me-pUTP-dsRNA),0,0625 pg/μL (para 5-OMe-UTP-dsRNA).

    2. Precisão: CV de Intra-Ensaio ≤10%, CV de Inter-Ensaio ≤10%

    3. Recuperação:80%~120%

    4. Linearidade: 0,0156-0,5pg/μL (para UTP-, pUTP-dsRNA) 0,0312-1pg/μL (para dsRNA N1-Me-pUTP), 0,0625-1pg/μL (para 5-OMe-UTP-dsRNA).

     

    Considerações

    1. A temperatura e o tempo de reação TMB são críticos, controle-os estritamente de acordo com as instruções.

    2. Para obter uma boa reprodutibilidade e sensibilidade do ensaio, é essencial uma lavagem adequada das placas para remover o excesso de reagentes que não reagiram.

    3. Todos os reagentes devem ser bem misturados antes do uso e evitar problemas durante a adição de amostras ou reagentes.

    4. Se cristais se formarem no tampão de lavagem concentrado (20x), aqueça a 37°C e misture suavemente até que os cristais estejam completamente dissolvidos.

    5. Evite analisar amostras que contenham Azida de Sódio (NaN3), pois pode destruir a atividade da HRP, resultando na subestimação da quantidade de dsRNA.

    6. Evite a contaminação por RNase durante o ensaio.

    7. O padrão/amostra, o anticorpo de detecção e o SA-HRP também podem ser conduzidos à temperatura ambiente sem agitação, mas isto pode causar uma diminuição da sensibilidade de detecção em uma vez.Para este caso, recomendamos que os padrões de dsRNA UTP e pUTP sejam diluídos de 2pg/μL, os padrões de dsRNA N1-Me-pUTP devem ser diluídos de 4pg/μL e o padrão de dsRNA 5-OMe-UTP deve ser diluído de 8pg/μL.Além disso, incubar a solução de trabalho HRP-estreptavidina por 60 minutos em temperatura ambiente.Não use o agitador de frascos, pois o agitador de frascos pode resultar em resultados imprecisos.

     

    Resultado típico

    1. Dados da curva padrão

    concentração

    (pg/μl)

    Padrão de dsRNA modificado N1-Me-pUTP

    OD450-OD650(1)

    OD450-OD650(2)

    MÉDIA

    2

    2.8412

    2.7362

    2.7887

    1

    1,8725

    1.9135

    1,8930

    0,5

    1.0863

    1.1207

    1.1035

     

     ”"

    0,25

    0,623

    0,6055

    0,6143

    0,125

    0,3388

    0,3292

    0,3340

    0,0625

    0,1947

    0,1885

    0,1916

    0,0312

    0. 1192

    0,1247

    0,1220

    0

    0,0567

    0,0518

    0,0543

    2. Cálculo da curva padrão

    3. Faixa de detecção do forro: 0,0312- 1pg/μL

    Concentração (pg/μl)

    OD450-OD650

    1

    1,8930

    0,5

    1.1035

    ”"

    0,25

    0,6143

    0,125

    0,3340

    0,0625

    0,1916

    0,0312

    0,1220

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