mRNA Cap2'-O-Metiltransferase

O mRNA Cap 2´ -O-metiltransferase foi derivado de uma cepa recombinante de E. coli que carrega o gene para o mRNA Cap 2 ´-O-Metiltransferase da vacina.Esta enzima adiciona um grupo metil na posição 2'-O do primeiro nucleotídeo adjacente à estrutura cap na extremidade 5' do RNA. A enzima utiliza S-adenosilmetionina (SAM) como um doador de metil para metilar o RNA capeado (cap -0) resultando em uma estrutura cap-1.

A estrutura Cap1 pode aumentar a eficiência da tradução, melhorando a expressão do mRNA em experimentos de transfecção e microinjeção. Esta enzima requer especificamente RNA com um cap m7GpppN como substrato.Não pode utilizar RNA com pN, ppN, pppN ou GpppN na extremidade 5'.O ARN capeado pode ser preparado através de transcrição in vitro utilizando análogo cap ou através de capeamento enzimático utilizando a Enzima Capping Vaccinia.

Componentes

mRNA Cap 2´-O-Metiltransferase (50U/μL)

Tampão de reação 10×Capping

Armazenar

-25 ～- 15 ℃ para armazenamento (Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento)

Buffer de armazenamento

20 mM Tris-HCl (pH 8,0,25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% glicerol.

Definição de unidade

Uma unidade é definida como a quantidade de enzima necessária para metilar 10 pmoles de transcrito de RNA encapsulado de 80 nt em 1 hora a 37°C.

Ensaios de controle de qualidade

Exonuclease:50U de mRNA Cap 2 ´ -O-Metiltransferase com 1μg de DNA digerido de λ-Hind III a 37 ℃ por 16 horas não produz degradação conforme determinado por eletroforese em gel de agarose.

Endonuclease: 50 U de mRNA Cap 2 ´ -O-Metiltransferase com 1 μg de λDNA a 37°C por 16 horas não produz degradação conforme determinado por eletroforese em gel de agarose.

Nickase: 50U de mRNA Cap 2 ´ -O-Metiltransferase com 1μg de pBR322 a 37 ℃ por 16 horas não produz degradação conforme determinado por eletroforese em gel de agarose.

RNase: 50U de mRNA Cap 2 ´ -O-Metiltransferase com 1,6μg de RNA MS2 por 4 horas a 37°C não produz degradação conforme determinado por eletroforese em gel de agarose.

E. coli ADN: 50U de mRNA Cap 2 ´ -O-Metiltransferase são rastreados quanto à presença deE. coli DNA genômico usando TaqMan qPCR com primers específicos para oE. coli Locus 16S rRNA.OE. coli contaminação de DNA genômico é =1E. coli genoma.

Bacteriana Endotoxina: Teste LAL, de acordo com a Farmacopeia Chinesa IV edição 2020, método de teste de limite de gel, regra geral (1143).O conteúdo de endotoxinas bacterianas deve ser =10 EU/mg.

Sistema e condições de reação

1. Combine uma quantidade apropriada de RNA tampado e H2O livre de RNase em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL até um volume final de 16,0 µL.

2. Aquecer a 65°C durante 5 minutos seguido de um banho de gelo durante 5 minutos.

3. Adicione os seguintes componentes na ordem especificada (para metilação de RNA Capped

menos do que 10

*10× Tampão de reação de cobertura: Tris-HCl 500 mM (pH 8,0, 25 ℃), KCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM.

4. Incubar a 37°C durante 1 hora (recomenda-se 2 horas de incubação para o fragmento alvo inferior a 200 nt).

Formulários

Para melhorar a expressão de mRNA durante experimentos de microinjeção e transfecção.

Notas sobre uso

1. Antes da reação, o RNA deve ser purificado e dissolvido em água livre de nuclease, todas as soluções não devem conter EDTA e íons.

2. Recomenda-se aquecer a amostra de RNA a 65°C por 5 minutos antes da reação para remover a estrutura secundária na extremidade 5 da transcrição.Pode ser estendido para 10 min para estruturas complexas de 5´-terminais.