PNGase F
Peptídeo-N-Glicosidase F (PNGase F) é o método enzimático mais eficaz para remover quase todos os oligossacarídeos ligados a N das glicoproteínas.PNGase F é uma amidase, que cliva entre os resíduos mais internos de GlcNAc e asparagina de oligossacarídeos com alto teor de manose, híbridos e complexos de glicoproteínas ligadas a N.
Aplicativo
Esta enzima é útil para remoção de resíduos de carboidratos de proteínas.
Preparação e especificação
| Aparência | Líquido Incolor |
| Pureza proteica | ≥95% (de SDS-PAGE) |
| Atividade | ≥500.000 U/mL |
| Exoglicosidase | Nenhuma atividade pôde ser detectada (ND) |
| Endoglicosidase F1 | ND |
| Endoglicosidase F2 | ND |
| Endoglicosidase F3 | ND |
| Endoglicosidase H | ND |
| Protease | ND |
Propriedades
| Número CE | 3.5.1.52(Recombinante de microrganismo) |
| Peso molecular | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Ponto de isolação eletrica | 8. 14 |
| pH ideal | 7,0-8,0 |
| Temperatura ideal | 65°C |
| Especificidade do substrato | Clivagem de ligações glicosídicas entre GlcNAc e resíduos de asparagina Fig.1 |
| Sites de reconhecimento | Glicanos ligados a N, a menos que contenham α1-3 fucose Fig. 2 |
| Ativadores | TDT |
| Inibidor | FDS |
| Temperatura de armazenamento | -25 ~-15 ℃ |
| Inativação por Calor | Uma mistura de reação de 20 µL contendo 1 µL de PNGase F é inativada por incubação a 75 °C por 10 minutos. |
Fig. 1 Especificidade do substrato da PNGase F
Figura 2 Reconhecimento de PNGase F.
Quando os resíduos internos de GlcNAc estão ligados à α1-3 fucose, a PNGase F não pode clivar os oligossacarídeos ligados a N das glicoproteínas.Esta modificação é comum em plantas e em algumas glicoproteínas de insetos.
Ccomponentes
|
| Componentes | Concentração |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×tampão desnaturante de glicoproteína | 1000 µl |
| 3 | 10×GlicoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10%NP-40 | 1000 µl |
Definição de unidade
Uma unidade (U) é definida como a quantidade de enzima necessária para remover >95% do carboidrato de 10 µg de RNase B desnaturada em 1 hora a 37°C em um volume total de reação de 10 µL.
Condições de reação
1. Dissolva 1-20 µg de glicoproteína com água deionizada, adicione 1 µl de tampão desnaturante de glicoproteína 10× e H2O (se necessário) para perfazer um volume total de reação de 10 µl.
2.Incubar a 100°C por 10 min, esfriar em gelo.
3.Adicionar 2 µl de 10×GlycoBuffer 2, 2 µl de NP-40 a 10% e misturar.
4.Adicione 1-2 µl de PNGase F e H2O (se necessário) para perfazer um volume total de reação de 20 µl e misturar.
5.Incubar a reação a 37°C por 60 min.
6.Para análise SDS-PAGE ou análise HPLC.
