Kit PCR direto da planta

Número do gato: HCR2020A

O kit Plant Direct PCR é adequado para amplificação direta de folhas de plantas, sementes, etc., e pode ser usado para triagem de alto rendimento de amostras de plantas que não contêm polissacarídeos e polifenóis.A DNA polimerase de amplificação direta baseada na evolução dirigida tem tolerância superior aos inibidores de PCR em plantas.Enquanto isso, mantém o alto desempenho de amplificação, que é adequado para a amplificação de fragmentos de DNA dentro de 5 kb.O tampão de lise A exclusivo do kit pode ser usado para lisar tecidos vegetais frescos ou congelados.É fácil de operar e o lisado pode ser usado como modelo para amplificação sem purificação.O sistema contém agentes protetores que permitem que amostras brutas sejam efetivamente amplificadas após repetidos congelamentos e descongelamentos.2 × Plant Direct Master Mix só precisa adicionar primers e modelos para realizar a reação de amplificação, reduzindo assim as operações de pipetagem e melhorando o rendimento de detecção e a reprodutibilidade dos resultados.

Componentes

*Plant Direct Lysis Buffer B é um reagente opcional, que é usado para neutralizar o Plant Direct Lysis Buffer A para prolongar o tempo de armazenamento das amostras.Pode ser usado de acordo com a situação real.

Condições de armazenamento

2 × Plant Direct Master Mix, armazene em -30 ~ -15 ℃ e evite congelamentos e descongelamentos repetidos;Tampão de lise direta da planta, armazene em -30 ~ -15℃ ou 2 ~ 8℃.

Processo Experimental

Processamento de Amostras–Folha de planta

Método direto:Recomenda-se usar folhas novas.Use um furador com diâmetro fixo de 0,5 – 3 mm para obter uma amostra pequena e uniformea ​​e, em seguida, adicione a amostra diretamente ao sistema PCR (recomenda-se um sistema de 50 μl).Observe que certifique-se de que a amostra esteja na solução PCR e não contra a parede do tubo.Se a PCR direta for usada para amplificar fragmentos longos e amostras complexas, usar uma amostra com diâmetro menor (0,5 – 1 mm) como modelo pode ajudar a obter melhores resultados.

Método de lise de moagem:Recomenda-se usar folhas novas.Pegue um pequeno pedaço de folha (cerca de 1 - 3 mm de diâmetro), coloque-o em 20 μl de Plant Direct Lysis Buffer Ab e triture-o o máximo possível (esta etapa pode ser feita apertando a folha com uma ponta de pipeta de 100 μl para amassar a amostra).Se forem utilizados volumes maiores de tecido foliar (não excedam 7 mm), aumentar o volume do tampão de diluição para 50 μl.Depois que as folhas forem moídas, a solução deverá ficar verde.Após uma breve centrifugação, adicionar 1 μl do sobrenadante ao sistema PCR como modelo de reação.

Método de lise térmica:Recomenda-se usar folhas novas.Pegue um pequeno pedaço de folha (cerca de 1 – 3 mm de diâmetro), coloque-o em 20 μl de Plant Direct Lysis Buffer A e aqueça-o a 95°C por 5 – 10 min.O tempo de lise pode ser prolongado adequadamente para folhas que são difíceis de lisar (não mais de 20 min).Se forem utilizados volumes maiores de tecido foliar (não excedam 7 mm), aumentar o volume do tampão de diluição para 50 μl.Após o aquecimento, centrifugar brevemente e adicionar 1 μl de sobrenadante ao sistema PCR como modelo de reaçãob.

Processamento de Amostras–Plantar Semente

Método de lise de moagem:Use um bisturi para cortar sementes com um diâmetro de 5 mm, adicione-as a 100 μl de Plant Direct Lysis Buffer A e triture a amostra com uma ponta de pipeta ou outras ferramentas.Vortex brevemente e deixe repousar à temperatura ambiente durante 3 – 5 min.Certifique-se de que a amostra de sementes esteja submersa no tampão de diluição.Após uma breve centrifugação, adicione 1 μl do sobrenadante ao sistema PCR como modelo de reação.

Método de lise térmica:Use um bisturi para cortar sementes com um diâmetro de 5 mm, adicione-as a 100 μl de Plant Direct Lysis Buffer A e aqueça a 95°C durante 5 – 10 min.O tempo de lise pode ser prolongado adequadamente para folhas que são difíceis de lisar (não mais de 30 min).Após o aquecimento, centrifugar brevemente e adicionar 1 μl de sobrenadante ao sistema PCR como modelo de reaçãob.

a.Tesouras ou outras ferramentas também podem ser usadas para cortar amostras de tamanho adequado;se o punção ou a tesoura forem reutilizados, devem ser limpos com solução de hipoclorito de sódio a 2% antes de cada uso para evitar contaminação cruzada entre as amostras.

b.Certifique-se de que o tampão de lise Plant Direct esteja totalmente derretido antes de usar.Se o tampão for viscoso ou tiver precipitados, ele pode ser aquecido a 37°C para derreter completamente antes do uso.

c.O volume do modelo no sistema de reação pode ser ajustado adequadamente de acordo com a diferença no volume de material vegetal e diluente adicionado.

Tampão de lise direta da planta

O tampão de lise direta da planta A contido neste produto foi estritamente otimizado para liberar o genoma da maioria dos tecidos vegetais e é adequado para armazenamento de curto prazo de plantas brutas a 4 ℃.Se a amostra precisar ser armazenada por um longo período de tempo (por exemplo, 1 – 2 meses), recomenda-se transferir o sobrenadante para um novo tubo EP e armazená-lo a -20°C.Para armazenar as amostras de forma mais estável, adicione um volume igual de Plant Direct Lysis Buffer B ao sobrenadante transferido, misture bem e armazene a -20°C.O tempo de armazenamento estável varia de acordo com amostras e estados da planta.

Sistema de reação

a.Contém Mg²⁺a uma concentração final de 2 mM.

b.Recomenda-se utilizar uma concentração final de 0,4μM para cada primer.O uso excessivo de primers levará ao aumento da amplificação inespecífica.

c.A quantidade de amostra utilizada pode ser ajustada de acordo com a situação real.A quantidade utilizada em uma única reação de amostra bruta lisada pode ser ajustada entre 2% – 20% do volume total da reação.Usar muitas amostras pode causar falha na amplificação.

Programa de reação

a.A desnaturação inicial (98°C, 5 min) promove a lise do tecido vegetal, liberando DNA genômico que pode ser usado para amplificação por PCR.Não encurte o tempo nem diminua a temperatura.

b.Recomenda-se defini-lo igual ao valor Tm do primer ou 2 ~ 4℃ superior ao valor Tm.A DNA polimerase de amplificação direta usada neste produto é diferente da Taq DNA polimerase convencional e tem requisitos especiais para a temperatura de recozimento da reação; o uso de alta temperatura de recozimento pode efetivamente reduzir a amplificação inespecífica e melhorar a eficiência da amplificação.Para modelos complexos, a amplificação eficiente pode ser alcançada ajustando a temperatura de recozimento e prolongando o tempo de extensão.

c.Se a duração do produto de amplificação for ≤1 kb, o tempo de extensão é definido em 30 seg/kb;se o comprimento do produto de amplificação for >1 kb, o tempo de extensão é definido em 60 seg/kb.

d.Para amostras complexas ou amostras com baixo rendimento de amplificação, o número de ciclos pode ser aumentado adequadamente para 40-50 ciclos.

Formulários

É aplicável para amplificação direta de tecidos vegetais e triagem de alto rendimento de amostras de plantas que não contêm polissacarídeos e polifenóis.

Notas

Apenas para uso em pesquisa.Não deve ser usado em procedimentos de diagnóstico.

1. Para amplificação bruta de plantas ou amplificação direta, recomenda-se usar DNA genômico purificado como controle positivo antes de iniciar o experimento para garantir que o sistema, os primers e as operações estejam corretos.

2. A DNA polimerase de amplificação direta usada neste kit tem forte atividade de revisão.Se a clonagem TA precisar ser realizada, recomenda-se purificar o DNA antes de adicionar a adenina.

3. Orientação de projeto de primer:

a.Recomenda-se que a última base na extremidade 3′ do primer seja G ou C.

b.Devem ser evitadas incompatibilidades consecutivas nas últimas 8 bases na extremidade 3' do primer.c.Evite estruturas em gancho na extremidade 3′ do primer.

d.As diferenças no valor de Tm do primer direto e do primer reverso não devem ser superiores a 1°C e o valor de Tm deve ser ajustado para 60 ~ 72°C (o Primer Premier 5 é recomendado para calcular o valor de Tm).

e.Sequências adicionais de primers extras que não correspondam ao modelo não devem ser incluídas no cálculo do valor Tm do primer.

f.Recomenda-se que o conteúdo de GC do primer seja de 40% a 60%.

g.A distribuição global de A, G, C e T no primer deve ser tão uniforme quanto possível.Evite usar regiões com alto conteúdo de GC ou AT.

h.Evite a presença de sequências complementares de 5 ou mais bases dentro do iniciador ou entre dois iniciadores e evite a presença de sequências complementares de 3 ou mais bases na extremidade 3' de dois iniciadores.

eu.Use a função NCBI BLAST para verificar a especificidade do primer para evitar amplificação inespecífica.