Enzima de proteção do vírus Vaccinia

A enzima capping do vírus Vaccinia é derivada de uma cepa recombinante de E. coli que carrega os genes da enzima capping Vaccinia.Esta única enzima é composta por duas subunidades (D1 e D12) e possui três atividades enzimáticas (RNA trifosfatase e guanililtransferase pela subunidade D1 e guanina metiltransferase pela subunidade D12).A enzima capping do vírus Vaccinia é eficaz para catalisar a formação da estrutura cap, que pode anexar especificamente a estrutura cap 7-metilguanilato (m7Gppp, Cap 0) à extremidade 5 'do RNA.A estrutura Cap (Cap 0) desempenha um papel importante na estabilização, transporte e tradução do mRNA em eucariotos.Capping RNA por reação enzimática é um método eficaz e simples que pode melhorar significativamente a estabilidade e tradução do RNA para transcrição, transfecção e microinjeção in vitro.

Componentes

Enzima de proteção do vírus Vaccinia (10 U/μL)

10×tampão de cobertura

Condições de armazenamento

-25 ~ - 15 ℃ para armazenamento (Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento)

Buffer de armazenamento

Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM,

DTT 1 mM, EDTA 0,1 mM, Triton X-100 a 0,1%, glicerol a 50%.

Definição de Unidade

Uma unidade de Enzima Capping do vírus Vaccinia é definida como a quantidade de enzima necessária para incorporar 10pmol de GTP em um transcrito de 80nt em 1 hora a 37°C.

Controle de qualidade

Exonuclease:10U de enzima de proteção do vírus Vaccinia com 1 μg de DNA digerido por λ-Hind III a 37 ℃ por 16 horas não produz degradação conforme determinado por eletroforese em gel de agarose.

Endonuclease:10U de enzima de proteção do vírus Vaccinia com 1μg de λDNA a 37°C por 16 horas não produz degradação conforme determinado por eletroforese em gel de agarose.

Nickase:10U de enzima de cobertura do vírus Vaccinia com 1 μg de pBR322 a 37 ℃ por 16 horas não produz degradação conforme determinado por eletroforese em gel de agarose.

RNase:10U de enzima de cobertura do vírus Vaccinia com 1,6 μg de RNA MS2 por 4 horas a 37°C não produz degradação conforme determinado por eletroforese em gel de agarose.

1.coli DNA:10U da Enzima Capping do vírus Vaccinia são rastreados quanto à presença de DNA genômico de E. coli usando qPCR TaqMan com primers específicos para o locus 16S rRNA de E. coli.A contaminação do DNA genômico de E. coli é ≤1 genoma de E. coli.

2.Bacteriana Endotoxina: Teste LAL, de acordo com a Farmacopeia Chinesa IV edição 2020, método de teste de limite de gel, regra geral (1143).O conteúdo de endotoxinas bacterianas deve ser ≤10 EU/mg.

Sistema e condições de reação

1. Protocolo de nivelamento (volume de reação: 20 μL)

Este procedimento é aplicável à reação de nivelamento de 10μg de RNA (≥100 nt) e pode ser ampliado de acordo com as demandas experimentais.

I) Combine 10μg de RNA e H2O livre de nuclease em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml até um volume final de 15,0 μL.*Tampão de cobertura 10×: Tris-HCl 0,5 M, KCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, (25 ℃, pH 8,0)

2) Aquecer a 65°C por 5 minutos seguido de banho de gelo por 5 minutos.

3) Adicione os seguintes componentes na ordem especificada

*10×Tampão de cobertura: Tris-HCl 0,5 M, KCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, (25 ℃, pH 8,0)

4) Incubar a 37°C durante 30 minutos, o RNA está agora tampado e pronto para aplicações a jusante.

2. terminal 5′ reação de rotulagem (volume de reação: 20 μL)

Este protocolo foi projetado para rotular RNA contendo um trifosfato 5' e pode ser ampliado de acordo com a demanda.A eficiência da incorporação do rótulo será afetada pela proporção molar de RNA: GTP, bem como pelo conteúdo de GTP nas amostras de RNA.

1) Combine a quantidade apropriada de RNA e H2O livre de nuclease em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml até um volume final de 14,0 μL.

2) Aquecer a 65°C por 5 minutos seguido de banho de gelo por 5 minutos.

3) Adicione os seguintes componentes na ordem especificada.

** GTP MIX refere-se a GTP e um pequeno número de marcadores.Para a concentração de GTP, consultepara a Nota 3.

4) Incubar a 37°C por 30 minutos, a extremidade 5' do RNA agora está marcada e pronta para uso a jusante.

Formulários

1. Capping mRNA antes dos ensaios de tradução/tradução in vitro

2. Rotulagem da extremidade 5' do mRNA

Notas sobre uso

1.O aquecimento da solução de RNA antes da incubação com a Vaccinia Capping Enzyme remove a estrutura secundária na extremidade 5' da transcrição.Aumente o tempo para 60 minutos para transcrições com 5'ends altamente estruturados e conhecidos.

2. O RNA utilizado para reações de capeamento deve ser purificado antes do uso e suspenso em água isenta de nuclease.O EDTA não deve estar presente e a solução deve estar isenta de sais.

3. Para rotular a extremidade 5', a concentração total de GTP deve ser cerca de 1-3 vezes a concentração molar de mRNA na reação.

4. O volume do sistema de reação pode ser aumentado ou diminuído de acordo com o real.