Mini Kit de Extração de DNA
Este kit adota sistema tampão otimizado e tecnologia de purificação de coluna de sílica gel, que pode recuperar fragmentos de DNA de 70 bp - 20 kb de várias concentrações de gel de agarose TAE ou TBE.A coluna de adsorção de DNA pode adsorver especialmente DNA sob condições de alto teor de sal.Além disso, o kit pode purificar diretamente fragmentos de DNA de produtos de PCR, sistemas de reação enzimática ou produtos de DNA bruto obtidos por outros métodos, e remover impurezas como proteínas, outros compostos orgânicos, íons de sal inorgânicos e primers oligonucleotídicos.Pode garantir que a purificação possa ser concluída dentro de 10-15 minutos.O DNA purificado pode ser usado diretamente para ligação, transformação, digestão enzimática, transcrição in vitro, PCR, sequenciamento, microinjeção, etc.
Condições de armazenamento
Armazenar entre -15 ~ -25°C e transportar em temperatura ambiente.
Componentes
| Componentes | (100 rxns) |
| PIB tampão | 80ml |
| Buffer GW | 2 × 20ml |
| Tampão de eluição | 20ml |
| Minicolunas FastPure DNA-G | 100 |
PIB tampão:Tampão de ligação ao DNA.
Buffer GW:Tampão de lavagem;adicione etanol absoluto no volume indicado no frasco antes de usar.
Tampão de eluição:Eluição.
Minicolunas FastPure DNA-G:Colunas de adsorção de DNA.
Tubos de coleta 2 ml:Tubos de coleta para filtrado.
Materiais Preparados
Tubos esterilizados de 1,5 ml, etanol absoluto e isopropanol (quando fragmento de DNA ≤100 pb, adicionar 1 volume
isopropanol para 1 volume de gel), banho-maria.
Processo Experimental
Adicione 80 ml de etanol para diluir o Tampão GW conforme indicado na etiqueta antes de usar, armazene em temperatura ambiente.
Mecanismo
1. Solução de reação PCR
Esquema de extração de gel:Adicionar volume igual Esquema de recuperação da solução de reação PCR do Buffer GDP:Adicione 5 vezes o volume do buffer
2. PIB Calcule o volume do gel(100 μeu é igual a 100 mg)
Dissolver gel
3. Pré-aqueça a 50 ~ 55℃
4. Vincular Lavagem
Adicione 300 μL de buffer GDP*
Adicione 700 μL de tampão GW
Adicione 700 μL de tampão GW
5. Eluir
Adicione 20 – 30μL de tampão de eluição ou água deionizada
Notas* Recuperação do fluido de reação PCR sem esta etapa
Programa de extração de gel
1. Após a electroforese de ADN para fraccionamento de fragmentos de ADN, excisar a tira única do fragmento de ADN do gel de agarose sob luz UV.Recomenda-se usar papel absorvente para absorver a umidade aparente do gel e minimizar o tamanho da fatia de gel, removendo o máximo possível de agarose extra.Pese a fatia de gel (sem tubo de microcentrífuga) para calcular seu volume: O volume da fatia de gel de 100 mg é de aproximadamente 100 μL, assumindo que a densidade é de 1 g/ml.
2. Adicione volume igual de tampão GDP, incube a 50 ~ 55 ℃ por 7-10 min (de acordo com o tamanho do gel, ajuste o tempo de incubação até que o gel esteja completamente dissolvido).Inverta o tubo 2 vezes durante a incubação.
Δ A adição de 1-3 volumes de Buffer GDP não influenciará a eficiência da recuperação de DNA.Se o fragmento de DNA a ser recuperado for <100 pb, será necessário adicionar 3 volumes de Buffer GDP;quando a fatia de gel estiver completamente dissolvida, adicione 1 volume de isopropanol e misture bem, depois continue para a próxima etapa.
3. Centrifugue brevemente para trazer a amostra para o fundo do tubo, insira as FastPure DNA Mini Columns-G nos tubos de coleta de 2 ml, transfira cuidadosamente a solução no máximo de 700 μL uma vez por
tempo para as colunas de filtração, centrifugar a 12.000 rpm (13.800 X g) durante 30-60 segundos.
4. Descarte o filtrado e adicione 300 μL de tampão GDP à coluna, incube em temperatura ambiente por 1 min, centrifugue a 12.000 rpm (13.800 X g) por 30-60 segundos.
5. Descarte o filtrado e adicione 700 μL de Tampão GW (verifique se o etanol absoluto foi adicionado antecipadamente!) à coluna, centrifugue a 12.000 rpm (13.800 X g) por 30-60 segundos.
Δ Adicione Buffer GW ao redor da parede da coluna de adsorção ou adicione a tampa traseira do Buffer GW e misture de cabeça para baixo por 2 a 3 vezes para ajudar a liberar completamente o sal aderido à parede do tubo.
6. Repita a etapa 5.
Δ A lavagem com tampão GW duas vezes pode garantir que o sal seja completamente removido e eliminar o impacto em experimentos subsequentes.
7. Descarte o filtrado e centrifugue a coluna vazia a 12.000 rpm (13.800 X g) por 2 min.
8. Insira a coluna em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 ml, adicione 20 - 30 μL de tampão de eluição ao centro da membrana da coluna, incube por 2 min e depois centrifugue a 12.000 rpm (13.800 X g) por 1 min.Descartar a coluna, armazenar o DNA obtido a -20ºC.
Δ Transferir o sobrenadante da etapa 8 para a coluna para eluir novamente e pré-aquecer o tampão de eluição a 55ºC (quando o fragmento de DNA >3 kb) pode ser útil para aumentar a eficiência da recuperação.
Programa de recuperação de produtos PCR
Este protocolo é aplicável para purificar fragmentos de DNA de produtos de PCR, sistema de reação enzimática e outros produtos brutos de DNA (incluindo DNA genético).Esta solução pode remover com eficiência vários nucleotídeos, primers, dímeros de primers, moléculas de sal, enzimas e outras impurezas.
1. Centrifugue brevemente os produtos de PCR, a solução de reação enzimática e outros produtos brutos de DNA.Estime o volume com uma pipeta e transfira para um tubo esterilizado de 1,5 ml ou 2 ml.Adicionar ddH2O até o volume atingir 100 μL;enquanto para DNA genômico com alta concentração, a diluição para 300 μL com ddH2O ajudará a melhorar a eficiência da recuperação.
2. Adicione 5 volumes de Buffer GDP, misture bem invertendo ou agitando em vórtice.Se o fragmento de DNA de interesse >100 pb, será necessário adicionar 1,5 volumes adicionais (amostras + PIB tampão) de etanol.
3. Insira a coluna novamente no tubo de coleta, transfira o mixtrue para a coluna e centrifugue a 12.000 rpm (13.800 ×g) por 30 – 60 segundos.Se o volume da solução misturada for >700 μL, coloque a coluna de adsorção de volta no tubo de coleta, transfira a solução restante para a coluna de adsorção e centrifugue a 12.000 rpm (13.800 × g) por 30 – 60 segundos.
4. A próxima execução refere-se à etapa 5 – 8 do programa de extração 08-1/Gel.
Formulários
Várias concentrações de gel de agarose TAE ou TBE;Produtos de PCR, sistemas de reação enzimática ou outros produtos brutos de DNA obtidos por vários métodos.Os fragmentos recuperados variaram de70 pb -20 kb.
Notas
Apenas para uso em pesquisa.Não deve ser usado em procedimentos de diagnóstico.
1. Adicione 80 ml de etanol para diluir o Tampão GW conforme indicado na etiqueta antes de usar, armazene em temperatura ambiente.
2. Se o PIB tampão for fácil de precipitar durante o armazenamento em baixa temperatura, ele pode ser colocado em temperatura ambiente por um período de tempo antes do uso.Se necessário, pode ser pré-aquecido em banho-maria a 37 ℃ até que o precipitado esteja completamente dissolvido, podendo então ser utilizado após mistura.
3. Defina a temperatura do banho-maria para 50 ~ 55 ℃ com antecedência.
4. Na etapa 1 do programa de extração 08-1/Gel, minimizar o tamanho da fatia de gel reduzirá significativamente o tempo de dissolução e aumentará a eficiência de recuperação (o DNA linearizado é facilmente hidrolisado quando continuamente exposto a alta temperatura).Não exponha o gel de DNA aos raios UV por muito tempo, pois a luz ultravioleta pode causar danos ao DNA.
5. Dissolva completamente o gel na etapa 2 do programa de extração 08-1/Gel, caso contrário a eficiência da recuperação do DNA será seriamente afetada.
6. Pré-aqueça o tampão de eluição ou ddH2O a 55°C, o que é útil para melhorar a eficiência da eluição do DNA.Recomenda-se armazenar DNA em eluente de Tris-HCl 2,5 mM, pH 7,0 – 8,5.
