Kit Maxi Plasmídeo EndoFree
Este kit é adequado para extração de 150 – 300 ml de solução bacteriana cultivada durante a noite, usando um método melhorado de lise alcalina SDS para lisar as bactérias.O extrato bruto é combinado seletivamente com um eliminador de endotoxinas exclusivo e separado por centrifugação para remover endotoxinas.Então, a membrana de sílica gel se liga seletivamente ao DNA plasmídico na solução sob condições de alto teor de sal e baixo pH.Isto é seguido pela adição de tampão de lavagem para remover impurezas e outros componentes bacterianos.Finalmente, um tampão de eluição com baixo teor de sal e alto pH é usado para eluir o DNA plasmídico puro da membrana da matriz de silício.A membrana de sílica gel emprega uma membrana de adsorção especial, e a diferença na quantidade de adsorção entre a coluna e a coluna é muito pequena e a repetibilidade é boa.Fenol, clorofórmio e outros reagentes tóxicos não são necessários, nem as etapas de precipitação com etanol.Este kit pode ser usado para extrair rapidamente 0,2 -1,5 mg de DNA plasmídico puro de alta cópia, com uma taxa de extração de 80% -90%.O kit utiliza uma fórmula de processo exclusiva que remove endotoxinas, o conteúdo de endotoxina é extremamente baixo e o efeito de transfecção celular é excelente.O plasmídeo extraído pode ser usado diretamente em digestão enzimática, PCR, transcrição in vitro, transformação, sequenciamento e outros experimentos de biologia molecular.
Condições de armazenamento
RNaseA deve ser armazenado a -30 ~ -15°C e transportado a ≤0°C.
O eliminador de endotoxina pode ser armazenado a 2 ~ 8 ℃ por um mês, armazenado a -30 ~ -15 ℃ para armazenamento a longo prazoe transportado a ≤0℃.
Outros componentes devem ser armazenados em temperatura ambiente (15 ~25°C) e transportados em temperatura ambiente.
Componentes
| Componentes | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| Tampão P1 | 75ml |
| Tampão P2 | 75ml |
| Tampão P4 | 75ml |
| Eliminador de endotoxinas | 25ml |
| PW do buffer | 2 × 22ml |
| Tampão TB | 20ml |
| Colunas FastPure DNA Maxi (cada uma em um tubo de coleta de 50ml) | 10 |
| Tubo de coleta sem endotoxinas | 2×5 |
RNaseA:10 mg/ml, usado para remover RNA.
Tampão P1:tampão de suspensão bacteriana, adicione RNaseA ao tampão P1 antes da primeira utilização.
Tampão P2:tampão de lise bacteriana (contendo SDS/NaOH).
Tampão P4:tampão neutralizante.
Eliminador de endotoxinas:efetivamente remover a endotoxina do extrato de plasmídeo bruto.
PW do buffer:tampão de lavagem, adicione o volume estipulado de etanol antes da primeira utilização.
Tampão TB:tampão de eluição.
Colunas FastPure DNA Maxi:colunas de adsorção de DNA plasmídico.
Tubos de coleta 50 ml:tubos de coleta de filtrado.
Tubo de coleta sem endotoxinas:tubos de coleta de DNA plasmídico.
Materiais Preparados
Etanol absoluto, isopropanol, tubos de centrífuga de fundo redondo de 50 ml e tubos de centrífuga de 50 ml isentos de endotoxinastubos de centrífuga.
Formulários
Este produto é adequado para extração em larga escala de plasmídeos de 150 a 300 ml de solução bacterianacultivado durante a noite.
Processo Experimental
1. Pegue 150 – 200 ml (não mais que 300 ml) de solução bacteriana cultivada durante a noite e centrifugue acerca de 11.000 rpm (12.000 × g) por 1 – 2 min.Descarte o sobrenadante e colete bactérias.
Δ Ao coletar mais de 50 ml de solução bacteriana, as bactérias podem ser coletadas adicionando solução bacteriana, centrifugação, descartando o sobrenadante e outras etapas no mesmo tubo de 50 ml para
várias vezes.
2. Adicione 7,5 ml de tampão P1 (verifique se RNaseA foi adicionado ao tampão P1) à centrífugatubo contendo bactérias e misture bem por vórtice ou pipetagem.
Δ A ressuspensão completa das bactérias nesta etapa é crítica para o rendimento e não deve haver aglomerados bacterianos após a ressuspensão.Se houver aglomerados de bactérias que não estejam bem misturados, isso afetará a lise, resultando em baixo rendimento e pureza.Se a DO600 da solução bacteriana for 0,65, recomenda-se a utilização de 7,5 ml de tampão P1 na extração de 150 ml de solução bacteriana;quando a DO600 for 0,75, devem ser utilizados 8 ml de tampão P1 e os volumes dos tampões P2 e P4 devem ser alterados em conformidade.Se o volume da solução bacteriana for aumentado para 200 ml, recomenda-se que oo volume dos tampões P1, P2 e P4 seja aumentado proporcionalmente.
3. Adicione 7,5 ml de Tampão P2 à suspensão bacteriana da etapa 2 e misture suavemente para cima e para baixo por 6 – 8vezes e incubar à temperatura ambiente durante 4 – 5 min.
Δ Inverta suavemente para misturar bem.O vórtex causará a fragmentação do DNA genômico, resultando em fragmentos de DNA genômico no plasmídeo extraído.Neste momento, a solução torna-se viscosa e translúcida, mostrando que as bactérias foram totalmente lisadas.A duração não deve exceder 5 minutos para evitar a destruição dos plasmídeos.Se a solução não estiver límpida, pode haver demasiadas bactérias, resultando emlise incompleta, portanto a quantidade de bactérias deve ser reduzida adequadamente.
4. Adicione 7,5 ml de tampão P4 à suspensão bacteriana do passo 3 e inverta imediatamente suavemente 6 a 8 vezes para permitir que a solução neutralize completamente o tampão P2.Neste momento deve aparecer um precipitado floculento branco.Centrifugar a mais de 11.000 rpm (12.000 × g) por 10 a 15 min, pipetar cuidadosamente o sobrenadante em um novo tubo de centrífuga de fundo redondo de 50 ml (preparado automaticamente) e evitaraspirar o precipitado branco flutuante.
Δ Adicione o tampão P4 e inverta imediatamente para misturar bem.Deixar o tubo repousar até que o precipitado branco esteja distribuído uniformemente pela solução para evitar a produção de precipitação local que poderia afetar a neutralização.Se não houver precipitado floculento branco uniforme antes da centrifugação e o sobrenadante não estiver límpido após a centrifugação, o tubo pode sercentrifugado por mais 5 min.
5. Adicione 0,1 vez o volume (10% do volume do sobrenadante, cerca de 2,2 ml) de Endotoxin Scavenger ao sobrenadante da etapa 4 e inverta para misturar.Coloque a solução em um banho de gelo ou insira em gelo picado (ou freezer) por 5 min até que a solução mude de turva para límpida e transparente (ou aindaligeiramente turvo) e ocasionalmente misturar várias vezes.
Δ Após o eliminador de endotoxina ser adicionado ao sobrenadante, o sobrenadante ficará turvo, mas oo sobrenadante deve ficar claro (ou ligeiramente turvo) após resfriamento no banho de gelo.
6. Depois que o sobrenadante for colocado em temperatura ambiente (>25°C) por 10 a 15 minutos, ele ficará turvo conformesua temperatura aumenta até a temperatura ambiente.Então o sobrenadante deve ser invertido para misturar.
Δ Se a temperatura ambiente for mais baixa ou se você quiser reduzir o tempo de extração, o sobrenadante pode ser incubado em banho-maria de 37 ~ 42 ℃ por 5 a 10 min e a próxima etapa pode ser realizada após o sobrenadantefica turvo.
7. Centrifugue o sobrenadante a cerca de 11.000 rpm (12.000 × g) durante 10 min à temperatura ambiente (a temperatura deve ser >25°C) para separar a fase.A fase aquosa superior contém o DNA, enquanto a camada inferior da fase oleosa azul contém endotoxina e outras impurezas.Transfira ofase aquosa contendo DNA para um novo tubo edescarte a camada oleosa.
Δ A temperatura durante a centrifugação deve ser superior a 25°C, pois a separação de fases eficaz nãoocorrer se a temperatura estiver muito baixa.
Δ Se a separação de fases não for eficaz, a temperatura de centrifugação pode ser ajustada para 30°C eo tempo de centrifugação pode ser aumentado para 15 min.
Δ Não chupe a camada oleosa azul, pois ela contém endotoxina e outras impurezas.
Mecanismo
Neutralização de Lise por Ressuspensão
◇ Adicione 7,5 ml de tampão P1
◇ Adicione 7,5 ml de tampão P2
◇ Adicione 7,5 ml de tampão P4
Remoção de endotoxinas
◇Adicione 0,1 vezes o volume sobrenadante do Endotoxin Scavenger
Encadernação e Lavagem
◇ Adicione 0,5 vezes o volume de isopropanol
◇ Adicione 10 ml de tampão PW
◇ Adicione 10 ml de tampão PW
Eluição
◇ Adicione 1 – 2 ml de tampão TB ou ddH2O sem endotoxina
