Transcriptase reversa M-MLV Neoscript
Neoscript Reverse Transcriptase é uma transcriptase reversa obtida por triagem de mutação do gene M-MLV da origem e expressão do vírus da leucemia murina Moloney em E.coli.A enzima remove a atividade da RNase H, tem maior tolerância à temperatura e é adequada para transcrição reversa em alta temperatura.Portanto, é útil para eliminar os efeitos desfavoráveis da estrutura de alto nível do RNA e de fatores não específicos na síntese de cDNA, e possui maior estabilidade e capacidade de síntese de transcrição reversa.A enzima possui maior estabilidade e capacidade de síntese de transcrição reversa.
Componentes
1.200 U/μL Transcriptase Reversa Neoscript
2.5 × Buffer de primeira cadeia (opcional)
* 5 × First-Strand Buffer não contém dNTP, adicione dNTPs ao preparar o sistema de reação
Aplicação recomendada
1.qRT-PCR de uma etapa.
2.Detecção de vírus RNA.
Condição de armazenamento
-20°C para armazenamento de longo prazo, deve ser bem misturado antes do uso, evitar congelamento-descongelamento frequente.
Definição de Unidade
Uma unidade incorpora 1 nmol de dTTP em 10 minutos a 37°C usando poli(A)•oligo(dT)25como modelo/primer.
Controle de qualidade
1.Pureza eletroforética de SDS-PAGE superior a 98%.
2.Sensibilidade de amplificação, controle lote a lote, estabilidade.
3.Sem atividade de nuclease exógena, sem endonuclease exógena ou contaminação por exonuclease
Configuração de reação para solução de primeira reação em cadeia
1.Preparação da mistura reacional
| Componentes | Volume |
| Oligo(dT)12-18 Cartilha ou Primer Aleatórioa Ou Primers Específicos de Genesb | 50 pmoles |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmoles | |
| 10 mM de dNTP | 1 μL |
| Modelo de RNA | RNA total≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| dH livre de RNase2O | Para 10 μL |
Notas:a/b: Selecione diferentes tipos de primers de acordo com suas necessidades experimentais.
2.Aquecer a 65°C durante 5 minutos e arrefecer rapidamente em gelo durante 2 minutos.
3.Adicione os seguintes componentes ao sistema acima até um volume total de 20 µL e misture suavemente:
| Componentes | Volume (μL) |
| 5 × Buffer de Primeira Cadeia | 4 |
| Transcriptase reversa Neoscript (200 U/μL) | 1 |
| Inibidor de RNase (40 U/μL) | 1 |
| dH livre de RNase2O | Para 20 μL |
4. Execute a reação de acordo com as seguintes condições:
(1) Se for usado Random Primer, a reação deve ser realizada a 25°C por 10 minutos e depois a 50°C por 30~60 minutos;
(2) Se forem usados Oligo dT ou primers específicos, a reação deve ser realizada a 50°C por 30~60 minutos.
5.Aqueça a 95°C por 5 minutos para inativar a Transcriptase Reversa Neoscript e encerrar a reação.
6.Os produtos de transcrição reversa podem ser usados diretamente na reação PCR e na reação PCR quantitativa de fluorescência, ou armazenados a -20 ℃ por um longo tempo.
PCR-Rreação:
1.Preparação da mistura reacional
| Componentes | Concentração |
| 10 × Tampão PCR (sem dNTP, sem Mg²+) | 1× |
| dNTPs (10mM cada dNTP) | 200 μM |
| 25 mM de MgCl22 | 1-4mm |
| Polimerase de DNA Taq (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Modeloa | ≤10% de solução de primeira reação em cadeia (2 μL) |
| ddH2O | Para 50 μL |
Notas:a: Se for adicionada muita solução da primeira reação em cadeia, a reação PCR pode ser inibida.
2.Procedimento de reação PCR
| Etapa | Temperatura | Tempo | Ciclos |
| Pré-desnaturação | 95°C | 2-5 minutos | 1 |
| Desnaturação | 95°C | 10-20 segundos | 30-40 |
| anelamento | 50-60℃ | 10-30 segundos | |
| Extensão | 72℃ | 10-60 segundos |
Notas
1.Adequado para otimização de temperatura de transcrição reversa na faixa de 42°C~55°C.
2.Possui melhor estabilidade, é adequado para amplificação de transcrição reversa em alta temperatura.Além disso, é favorável para passar eficientemente por regiões estruturais complexas de RNA.Além disso,é adequado para detecção quantitativa de RT-PCR por fluorescência multiplex em uma etapa.
3.Boa compatibilidade com várias enzimas de amplificação por PCR e é adequado para reações de RT-PCR de alta sensibilidade.
4.Adequado para reação RT-PCR quantitativa de fluorescência em uma etapa de alta sensibilidade, melhora efetivamente a taxa de detecção de baixa concentração de modelos.
5.Adequado para construção de biblioteca de cDNA.
