Proteinase K NGS (pó)
Número do gato: HC4507A
NGS Protease K é uma serina protease estável com alta atividade enzimática e ampla especificidade de substrato. A enzima decompõe preferencialmente ligações éster e ligações peptídicas adjacentes ao terminal C de aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos contendo enxofre e aminoácidos aromáticos.Portanto, é frequentemente usado para degradar proteínas em peptídeos curtos.NGS Protease K é uma serina protease típica com o Asp39-Dele69-Ser224tríade catalítica que é exclusiva das serina proteases, e o centro catalítico é cercado por reboque de Ca2+locais de ligação para estabilização, mantendo alta atividade enzimática sob uma ampla gama de condições.
Especificação
| Aparência | Pó amorfo branco a esbranquiçado, liofilizado |
| Atividade específica | ≥40U/mg de sólido |
| DNase | Nenhum detectado |
| RNase | Nenhum detectado |
| Carga biológica | ≤50CFU/g sólido |
| Resíduo de ácido nucleico | <5pg/mg de sólido |
Propriedades
| Fonte | Álbum Tritirachium |
| Número CE | 3.4.21.64(Recombinante do álbum Tritirachium) |
| Peso molecular | 29kDa (PÁGINA SDS) |
| Ponto de isolação eletrica | 7.81 Figura 1 |
| pH ideal | 7,0-12,0 (Todos realizam alta atividade) Fig.2 |
| Temperatura ideal | 65℃ Fig.3 |
| Estabilidade do pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16h) Fig.4 |
| Estabilidade térmica | Abaixo de 50 ℃ (pH 8,0, 30min) Fig.5 |
| Estabilidade de armazenamento | Armazenado a 25 ℃ por 12 meses Fig.6 |
| Ativadores | SDS, ureia |
| Inibidores | Fluorofosfato de diisopropil;fluoreto de benzilsulfonil |
Condições de armazenamento
Armazene o pó liofilizado a -25 ~ -15 ℃ por um longo período longe da luz;Após a dissolução, alíquota em volume apropriado para armazenamento de curto prazo a 2-8°C longe da luz ou armazenamento de longo prazo a -25~-15°C longe da luz.
Precauções
Use luvas e óculos de proteção ao usar ou pesar e mantenha bem ventilado após o uso.Este produto pode causar reações alérgicas na pele e irritação ocular grave.Se inalado, pode causar sintomas de alergia ou asma ou dispneia.Pode causar irritação respiratória.
Definição de unidade
Uma unidade de NGS Protease K é definida como a quantidade de enzima necessária para hidrolisar a caseína em 1 μmol L-tirosina sob condições de determinação padrão.
Preparação de reagentes
| Reagente | Fabricante | Catálogo |
| Caseína técnicade leite bovino | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm QuímicaReagente Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm QuímicaReagente Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm QuímicaReagente Co., Ltd. | 20040618 |
| Ácido tricloroacético | Sinopharm QuímicaReagente Co., Ltd. | 80132618 |
| Acetato de sódio | Sinopharm QuímicaReagente Co., Ltd. | 10018818 |
| Ácido acético | Sinopharm QuímicaReagente Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm QuímicaReagente Co., Ltd. | 10011018 |
| Carbonato de Sódio | Sinopharm QuímicaReagente Co., Ltd. | 10019260 |
| Folina-fenol | Sangon Biotech (Xangai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirosina | Sigma | 93829 |
Reagente I:
Substrato: Solução de caseína a 1% de leite bovino: dissolver 1g de caseína de leite bovino em 50ml de solução de fosfato de sódio 0,1M, pH 8,0, aquecer em banho-maria a 65-70 °C por 15 minutos, agitar e dissolver, esfriar com água, ajustar por hidróxido de sódio até pH 8,0 e diluir para 100ml.
Reagente II:
Solução de TCA: ácido tricloroacético 0,1 M, acetato de sódio 0,2 M e ácido acético 0,3 M (pesar 1,64 g de ácido tricloroacético + 1,64 g de acetato de sódio + 1,724 mL de ácido acético sucessivamente, adicionar 50 mL de água deionizada, ajustar com HCl para pH 4,03 e diluir em 100ml).
Reagente III:
0,4m de solução de carbonato de sódio (pesar 4,24g de carbonato de sódio anidro e dissolver em 100mL de água)
Reagente IV:
Reagente folin fenol: diluir 5 vezes com água deionizada.
Reagente V:
Diluente enzimático: solução de fosfato de sódio 0,1 M, pH 8,0.
Reagente VI:
Solução padrão de L-tirosina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirosina dissolvida com HCl 0,2M.
Procedimento
1. Ligue o espectrofotômetro UV-Vis e selecione a medição fotométrica.
2. Defina o comprimento de onda como 660 nm.
3. Ligue o banho-maria, ajuste a temperatura para 37 ℃ e garanta que a temperatura não se altere por 3-5 minutos.
4. Pré-aqueça 0,5mL de substrato em um tubo de centrífuga de 2mL em banho-maria a 37°C por 10 minutos.
5. Extraia 0,5 mL da solução enzimática diluída no tubo de centrífuga pré-aquecido por 10 minutos.Defina o diluente enzimático como grupo em branco.
6. Adicione 1,0 mL de reagente TCA imediatamente após a reação.Misture bem e incube em banho-maria por 30 minutos.
7. Centrifugue a solução de reação.
8. Adicione os seguintes componentes na ordem especificada.
| Reagente | Volume |
| Sobrenadante | 0,5ml |
| carbonato de sódio 0,4M | 2,5ml |
| Reagente folin fenol | 0,5ml |
9. Misture bem antes de incubar em banho-maria a 37°C por 30 minutos.
10. DO660foi determinado como DO1;grupo de controle em branco: O diluente enzimático é usado para substituir a solução enzimática para determinar a DO660como DO2, ΔOD=OD1-OD2.
11. Curva padrão de L-tirosina: 0,5 mL de solução de L-tirosina de concentração diferente, 2,5 mL de carbonato de sódio 0,4 M, 0,5 mL de reagente Folin fenol em tubo de centrífuga de 5 mL, incubar em 37 ℃ por 30 minutos, detectar OD660para diferentes concentrações de L-tirosina, obteve-se então a curva padrão Y=kX+b, onde Y é a concentração de L-tirosina, X é OD600.
Cálculo
2: Volume total da solução de reação (mL)
0,5: Volume de solução enzimática (mL)
0,5: Volume do líquido de reação usado na determinação cromogênica (mL)
10: Tempo de reação (min)
Df: Diluição múltipla
C: Concentração enzimática (mg/mL)
Figuras
Fig.1 Resíduo de DNA
| Amostra | Avenida C4 | Ácido nucleico Recuperação (pg/mg) | Recuperação(%) | Nucléico Total Ácido ( pg/mg) |
| PRK | 24,66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | - | - |
| DST1 | 12.955 |
- |
- |
- |
| DST2 | 16 | |||
| DST3 | 19.125 | |||
| DST4 | 23.135 | |||
| DST5 | 26.625 | |||
| H2O sem RNA | Indeterminado | - | - | - |
Fig.2 pH ideal
Fig.3 Temperatura ideal
Fig.4 Estabilidade do pH
Fig.5 Estabilidade térmica
Fig.6 Estabilidade de armazenamento a 25°C
