Proteinase K mNGS (líquida)
A proteinase K é uma serina protease estável com ampla especificidade de substrato.Degrada muitas proteínas no estado nativo mesmo na presença de detergentes.Evidências de estudos de estrutura cristalina e molecular indicam que a enzima pertence à família das subtilisinas com uma tríade catalítica de sítio ativo (Asp39-Dele69-Ser224).O local predominante de clivagem é a ligação peptídica adjacente ao grupo carboxila de aminoácidos alifáticos e aromáticos com grupos alfa-amino bloqueados.É comumente usado por sua ampla especificidade.Esta proteinase K foi especialmente desenvolvida para mNGS.Comparado com a outra proteinase K, contém ainda menos contaminação de ácidos nucleicos com o mesmo desempenho enzimático, o que poderia garantir melhor a aplicação mNGS a jusante.
Condições de armazenamento
2-8℃ por 2 anos
Especificação
| Aparência | Líquido incolor a marrom claro |
| Atividade | ≥800U/ml |
| Concentração de Proteína | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Nenhum detectado |
| DNase | Nenhum detectado |
| RNase | Nenhum detectado |
Propriedades
| Número CE | 3.4.21.64(Recombinante do álbum Tritirachium) |
| Ponto de isolação eletrica | 7,81 |
| pH ideal | 7,0-12,0 Figura 1 |
| Temperatura ideal | 65 ℃ Figura 2 |
| Estabilidade do pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Fig. 3 |
| Estabilidade térmica | Abaixo de 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig. |
| Estabilidade de armazenamento | Mais de 90% de atividade por 12 meses a 25 ℃ |
| Ativadores | SDS, ureia |
| Inibidores | Fluorofosfato de diisopropil;fluoreto de fenilmetilsulfonil |
Formulários
1. Kit de diagnóstico genético
2. Kits de extração de RNA e DNA
3. Extração de componentes não proteicos dos tecidos, degradação de impurezas proteicas, como DNAvacinas e preparação de heparina
4. Preparação de DNA cromossômico por eletroforese pulsada
5. Mancha ocidental
6. Reagentes enzimáticos de albumina glicosilada diagnóstico in vitro
Precauções
Use luvas e óculos de proteção ao usar ou pesar e mantenha bem ventilado após o uso.Este produto pode causar reações alérgicas na pele e irritação ocular grave.Se inalado, pode causar sintomas de alergia ou asma ou dispneia.Pode causar irritação respiratória.
Definição de unidade
Uma unidade (U) é definida como a quantidade de enzima necessária para hidrolisar a caseína para produzir 1 μmoltirosina por minuto nas seguintes condições.
Preparação de reagentes
Reagente I: 1g de caseína de leite foi dissolvida em 50ml de solução de fosfato de sódio 0,1M (pH 8,0), incubada em água a 65-70 ℃ por 15 minutos, agitada e dissolvida, resfriada com água, ajustada por hidróxido de sódio a pH 8,0 e volume fixo 100ml.
Reagente II: ácido tricloroacético 0,1M, acetato de sódio 0,2M, ácido acético 0,3M.
Reagente III: 0,4M Na2CO3solução.
Reagente IV: Reagente Forint diluído em água pura 5 vezes.
Reagente V: Diluente enzimático: solução de fosfato de sódio 0,1M (pH 8,0).
Reagente VI: solução de tirosina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml de tirosina dissolvida com 0,2MHCl.
Procedimento
1. 0,5 ml de reagente I é pré-aquecido a 37 ℃, adicione 0,5 ml de solução enzimática, misture bem e incube a37°C por 10 minutos.
2. Adicione 1ml de reagente II para interromper a reação, misture bem e continue a incubação por 30 minutos.
3. Centrifugue a solução de reação.
4. Pegue 0,5ml de sobrenadante, adicione 2,5ml de reagente III, 0,5ml de reagente IV, misture bem e incube a 37°C.por 30 minutos.
5. DO660foi determinado como DO1;grupo de controle em branco: 0,5ml de reagente V é usado para substituir a enzimasolução para determinar DO660como DO2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Curva padrão de L-tirosina: 0,5 mL de solução de L-tirosina de concentração diferente, 2,5 mL de Reagente III, 0,5 mL de Reagente IV em tubo de centrífuga de 5 mL, incubar em 37 ℃ por 30 minutos, detectar OD660para diferentes concentrações de L-tirosina, obteve-se então a curva padrão Y=kX+b, onde Y é a concentração de L-tirosina, X é OD600.
Cálculo
2: Volume total da solução de reação (mL)
0,5: Volume de solução enzimática (mL)
0,5: Volume do líquido de reação usado na determinação cromogênica (mL)
10: Tempo de reação (min)
Df: Diluição múltipla
C: Concentração enzimática (mg/mL)
Referências
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U e Hilz H. Biochem.Biofísica.Res.Comum.(1971);44:513.
3. Hilz, H.e outros,EUR.J. Bioquímica.(1975);56:103–108.
4. Sambrook J.et al., Clonagem Molecular: Um Manual de Laboratório, 2ª edição, Cold Spring HarborImprensa de Laboratório, Cold Spring Harbor (1989).
Figuras
Figo.1 Ótimo pH
Solução tampão 100 mM: pH 6,0-8,0, Na-fosfato;pH8,0-9,0, Tris-HCl;pH9,0-12,5, Glicina-NaOH. Concentração enzimática: 1mg/mL
Fig.2 Temperatura ideal
Reação em tampão K-fosfato 20 mM pH 8,0.Concentração enzimática: 1 mg/mL
Fig.3 pH Estabilidade
25 ℃, tratamento de 16 h com solução tampão 50 mM: pH 4,5- 5,5, acetato;pH 6,0-8,0, Na-fosfato;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glicina-NaOH.Concentração enzimática: 1 mg/mL
Fig.4 Térmica estabilidade
30 min de tratamento com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0.Concentração enzimática: 1 mg/mL
Fig.5 Armazenamento estávelty at 25℃
