Transcriptase reversa RTL
A transcriptase reversa RTL é uma DNA polimerase dependente de modelo de RNA que não possui atividade de exonuclease 3'→5' e possui atividade de RNase H.Esta enzima pode usar o RNA como modelo para sintetizar uma fita complementar de DNA, que pode ser aplicada à síntese da primeira fita de cDNA, especialmente para RT-LAMP (amplificação isotérmica mediada por loop).Em comparação com a transcriptase reversa RTL 1.0, a sensibilidade é significativamente melhorada, a estabilidade térmica é mais forte e a reação a 65°C é mais estável.A transcriptase reversa RTL (sem glicerol) pode ser usada para preparar preparações liofilizadas, reagentes RT-LAMP liofilizados, etc.
Definição de Unidade
Uma unidade incorpora 1 nmol de dTTP em material precipitável por ácido em 20 minutos a 50°C usando poli(A)•oligo(dT)25 como molde-primer.
Componentes
| Componente | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| Transcriptase reversa RTL (sem glicerol) (15U/μL) | 0,1 mL | 1ml | 10ml |
| Tampão 10×HC RTL | 1,5ml | 4×1,5 mL | 5×10 mL |
| MgSO4 (100mM) | 1,5ml | 2×1,5 mL | 3×10 mL |
Condição de armazenamento
Transporte abaixo de 0°C e armazenado entre -25°C~-15°C.
Controle de qualidade
- Atividade residual deEindonuclease:Uma reação de 50 μL contendo 1 μg de λDNA e 15 unidades de RTL2.0 incubada por 16 horas a 37 ℃ mostra o mesmo padrão do controle negativo por eletroforese em gel.
- Atividade residual deExonuclease:Uma reação de 50 μL contendo 1 μg de λDNA digerido com Hind Ⅲ e 15 unidades de RTL2.0 incubadas por 16 horas a 37 ℃ mostra o mesmo padrão do controle negativo por eletroforese em gel.
- Atividade residual deNickase:Uma reação de 50 μL contendo 1 μg de pBR322 superenrolado e 15 unidades de RTL2.0 incubadas por 4 horas a 37°C mostra o mesmo padrão do controle negativo por eletroforese em gel.
- Atividade residual deRNase:Uma reação de 10 μL contendo 0,48 μg de RNA MS2 e 15 unidades de RTL2.0 incubada por 4 horas a 37°C mostra o mesmo padrão do controle negativo por eletroforese em gel.
- E. coli gADN:Medido comE.colikits de detecção de HCD específicos, 15 unidades de RTL2.0 contêm menos de 1E. coligenoma.
Configuração de reação
Protocolo de síntese de cDNA
| Componentes | Volume |
| Modelo RNA a | opcional |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) ou mistura aleatória de Primer(60uM) | 2 μL |
| Mistura dNTP (10mM cada) | 1 μL |
| Inibidor de RNase (40U/uL) | 0,5 μL |
| Transcriptase reversa RTL 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| Tampão 10×HC RTL | 2 μL |
| Água sem nuclease | Até 20 μL |
Notas:
1) A dosagem recomendada de RNA total é de 1ng ~ 1μg
2) A dosagem recomendada de mRNA foi de 50ng~100ng
Termo-ciclismo Condições para uma rotina reação:
| Temperatura (°C) | Tempo |
| 25ºCa | 5 minutos |
| 55ºC | 10 minutosb |
| 80°C | 10 minutos |
Notas:
1) Se for usada Random Primer Mix, uma etapa de incubação a 25°C.
2) Se for usada a mistura de primers alvo, uma etapa de incubação a 55°C por 10~30 minutos.
Protocolo RT-LAMP
| Componentes | Volume | Concentração Final |
| Modelo de RNA | opcional | ≥10 cópias |
| Mistura dNTP (10mM) | 3,5 μL | 1,4mm |
| Primers FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| Primers F3/B3 (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| Primers LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| Inibidor de RNase (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reação |
| Transcriptase reversa RTL 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U/Reação |
| Polimerase de DNA Bst V2 (8U/μL) | 1 μL | 8U/Reação |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 μL | 6mm (Total 8mm) |
| Tampão 10×HC RTL (ou tampão 10×HC Bst V2) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Água sem nuclease | Até 25 μL | - |
Notas:
1) Misture em vórtex e centrifugue brevemente para coletar.Incubação à temperatura constante de 65°C durante 1 hora.
2) Os dois buffers são interoperáveis e possuem a mesma composição.
Notas
1.Este produto formará um sólido branco quando armazenado a -20 °C.Retire da temperatura de -20°C e coloque no gelo por cerca de 10 minutos.Após derreter, pode ser utilizado agitando e misturando.
2.O produto de cDNA pode ser armazenado a -20°C ou -80°C ou usado imediatamente para reação de PCR.
3.Para evitar a contaminação por RNase, mantenha a área experimental limpa e use luvas e máscaras limpas durante a operação.
