Pré-mistura universal SYBR GREEN qPCR (azul)
Número do gato: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (Dye Based) é uma pré-solução para amplificação quantitativa por PCR 2×em tempo real caracterizada por alta sensibilidade e especificidade, é de cor azul e tem o efeito de rastreamento de adição de amostra.O componente principal Taq DNA polimerase usa anticorpo hot start para inibir efetivamente a amplificação não específica devido ao recozimento do primer durante a preparação da amostra.Ao mesmo tempo, a fórmula adiciona os fatores promotores para melhorar a eficiência de amplificação da reação PCR e equalizar a amplificação de genes com diferentes conteúdos de GC (30 ~ 70%), para que a PCR quantitativa possa obter uma boa relação linear em uma ampla gama quantitativa. região.Este produto contém corante de referência passivo ROX especial, que é aplicável à maioria dos instrumentos qPCR.Não é necessário ajustar a concentração de ROX em diferentes instrumentos.Só é necessário adicionar primers e modelos para preparar o sistema de reação para amplificação.
Componentes
Mix mestre qPCR azul universal
Condições de armazenamento
O produto é enviado com bolsas de gelo e pode ser armazenado a -25°C~-15°C por 18 meses.É necessário evitar forte irradiação luminosa ao armazenar ou preparar o sistema de reação.
Especificação
| Concentração | 2× |
| Método de detecção | SYBR |
| Método PCR | qPCR |
| Polimerase | Taq DNA polimerase |
| Tipo de amostra | ADN |
| Equipamento de aplicação | A maioria dos instrumentos qPCR |
| Tipo de Produto | Pré-mistura SYBR para PCR quantitativo de fluorescência em tempo real |
| Inscrever-se em (aplicativo) | Expressão genetica |
Instruções
1. Sistema de reação
| Componentes | Volume (μL） | Volume (μL） | Concentração Final |
| Pré-mistura universal SYBR GREEN qPCR | 25 | 10 | 1× |
| Primer direto (10μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2μmol/L |
| Primer reverso (10μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2μmol/L |
| ADN | X | X | |
| ddH2O | até 50 | até 20 | - |
[Nota]: Misture bem antes de usar para evitar bolhas excessivas devido à agitação vigorosa.
a) Concentração do primer: A concentração final do primer é de 0,2μmol/L, podendo também ser ajustada entre 0,1 e 1,0μmol/L conforme apropriado.
b) Concentração do modelo: Se o modelo for uma solução estoque de cDNA não diluída, o volume utilizado não deve exceder 1/10 do volume total da reação qPCR.
c) Diluição do modelo: Recomenda-se diluir a solução estoque de cDNA de 5 a 10 vezes.A quantidade ideal de modelo adicionado é melhor quando o valor de Ct obtido por amplificação é de 20 a 30 ciclos.
d) Sistema de reação: Recomenda-se o uso de 20μL ou 50μL para garantir a eficácia e repetibilidade da amplificação do gene alvo.
e) Preparação do sistema: Prepare na bancada super limpa e utilize as pontas e tubos de reação sem resíduo de nuclease;recomenda-se utilizar pontas com cartuchos filtrantes.Evite contaminação cruzada e contaminação por aerossol.
2.Programa de reação
Programa Padrão
| Etapa do ciclo | Temperatura. | Tempo | Ciclos |
| Desnaturação inicial | 95°C | 2 minutos | 1 |
| Desnaturação | 95°C | 10 segundos | 40 |
| Recozimento/Extensão | 60°C | 30 segundos★ | |
| Estágio da curva de fusão | Padrões do instrumento | 1 | |
Programa rápido
| Etapa do ciclo | Temperatura. | Tempo | Ciclos |
| Desnaturação inicial | 95°C | 30 segundos | 1 |
| Desnaturação | 95°C | 3 segundos | 40 |
| Recozimento/Extensão | 60°C | 20 segundos★ | |
| Estágio da curva de fusão | Padrões do instrumento | 1 | |
[Nota]: O programa rápido é adequado para a grande maioria dos genes, e os programas padrão podem ser testados para genes individuais de estruturas secundárias complexas.
a) Temperatura e tempo de recozimento: Ajuste de acordo com o comprimento do primer e do gene alvo.
b) Aquisição do sinal de fluorescência (★): Defina o procedimento experimental de acordo com os requisitos das instruções de uso do instrumento.
c) Curva de fusão: O programa padrão do instrumento pode ser usado normalmente.
3. Análise de Resultados
Um mínimo de três réplicas biológicas foram necessárias para experimentos quantitativos.Após a reação, a curva de amplificação e a curva de fusão precisam ser confirmadas.
3.1 Curva de amplificação:
A curva de amplificação padrão tem formato de S.A análise quantitativa é mais precisa quando o valor Ct fica entre 20 e 30. Se o valor Ct for inferior a 10, é necessário diluir o modelo e realizar o teste novamente.Quando o valor Ct está entre 30-35, é necessário aumentar a concentração do molde ou o volume do sistema de reação, de modo a melhorar a eficiência da amplificação e garantir a precisão da análise dos resultados.Quando o valor de Ct é superior a 35, os resultados do teste não podem analisar quantitativamente a expressão do gene, mas podem ser usados para análise qualitativa.
3.2 Curva de fusão:
O único pico da curva de fusão indica que a especificidade da reação é boa e a análise quantitativa pode ser realizada;se a curva de fusão mostrar picos duplos ou múltiplos, a análise quantitativa não poderá ser realizada.A curva de fusão mostra picos duplos, e é necessário julgar se o pico não alvo é o dímero do primer ou a amplificação não específica por eletroforese em gel de DNA agarose.Se for um dímero de primer, recomenda-se reduzir a concentração do primer ou redesenhar os primers com alta eficiência de amplificação.Se for uma amplificação inespecífica, aumente a temperatura de recozimento ou redesenhe os primers com especificidade.
Notas
Por favor, use o EPI necessário, como jaleco e luvas, para garantir sua saúde e segurança！
Este produto é para uso exclusivo em pesquisas!
