Uracila DNA glicosilase
Uracil-DNA Glicosilase (UNG ou UDG) é um clone recombinante de E.coli com peso molecular de 25 kDa.Ele catalisa a liberação de uracila livre de DNA de fita simples e dupla contendo uracila, e é inativo contra RNA, e pode ser usado para prevenir a contaminação de produtos de amplificação por PCR.O princípio de ação baseia-se no fato de que se dUTP for substituído por dTTP na reação de PCR e um produto de amplificação de PCR contendo bases dU for formado, a enzima pode quebrar seletivamente a ligação glicosídica das bases U em fita simples e fita dupla. DNA e degradar o produto de amplificação por PCR.
Aplicação recomendada
Amplificação de Prevenção de Contaminação
Condição de armazenamento
-20°C para armazenamento de longo prazo, deve ser bem misturado antes do uso, evitar congelamento-descongelamento frequente.
Buffer de armazenamento
Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, Estabilizador, 50% de glicerol.
Definição de Unidade
A quantidade de enzima necessária para degradar 1 µg de DNA de fita simples contendo bases dU em 1 hora a 37°C é de 1 unidade.
Controle de qualidade
1.Pureza eletroforética SDS-PAGE superior a 98%
2.Sensibilidade de amplificação, controle lote a lote, estabilidade
3.Após 1U de UNG ser tratado a 50°C por 2 minutos, o modelo contendo U abaixo de 103 cópias deverá estar completamente degradado e nenhum produto de amplificação poderá ser produzido
4.Nenhuma atividade de nuclease exógena
Instruções
| Componentes | Volume (μL) | Concentração final |
| 10 × Tampão PCR (sem dNTP, Mg²+livre) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (substituir dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM de MgCl22 | 2-8 μL | 1-4mm |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Mistura de Primera | 2 | 1× |
| Modelo | - | <1μg/reação |
| ddH₂O | Até 50 | - |
Observação: a: Se usado para qPCR/qRT-PCR, a sonda fluorescente deve ser adicionada ao sistema de reação.Normalmente, uma concentração final de primer de 0,2 μM pode dar bons resultados;quando o desempenho da reação é ruim, a concentração do primer pode ser ajustada na faixa de 0,2-1 μM.Normalmente, a concentração da sonda é otimizada na faixa de 0,1-0,3 μM.Experimentos de gradiente de concentração podem ser realizados para encontrar a melhor combinação de primer e sonda.
Notas
1.A enzima UNG pode ser usada para remover os produtos de amplificação dUTP contaminados do sistema de reação antes da reação de amplificação por PCR, para evitar resultados falso-positivos devido à contaminação do produto.
2.A temperatura ideal para a enzima UNG ser usada na reação PCR anticontaminação é geralmente 50°C por 2 minutos;a condição de inativação é 95°C por 5 minutos.
3.Evite congelamentos e descongelamentos frequentes e não exponha a grandes flutuações de temperatura.
4.Diferentes genes a serem amplificados possuem diferentes eficiências de utilização do dUTP e sensibilidade à enzima UNG, portanto, se o uso do sistema UNG levar a uma diminuição na sensibilidade de detecção, o sistema de reação deverá ser ajustado e otimizado, caso necessite de suporte técnico, entre em contato nossa empresa.
